Blotting DNA – transfer DNA z żelu agarozowego lub żelu poliakrylamidowego na membranę (filtr) hybrydyzacyjną najczęściej w celu hybrydyzacji z sondą, będącą znakowanym jednoniciowym DNA komplementarnym do badanej sekwencji w próbie.
Membrany (filtry) hybrydyzacyjne Membrana hybrydyzacyjna wykonana jest najczęściej z nitrocelulozy lub nylonu. Na membranie celulozowej można wykonać hybrydyzację jednokrotnie (rzadko więcej niż jeden raz), a na membranie nylonowej – wielokrotnie (po usunięciu sondy użytej w pierwszej hybrydyzacji). Poza tym membrana nylonowa jest mniej krucha i nie wymaga zwilżania przed nałożeniem próby.
Elektroforeza Wykonuje się ją w żelu agarozowym o stężeniu około 0,8–1,5%. Dla dsDNA i dsRNA wykonuje się ją w warunkach denaturujących, tak by otrzymać formy jednoniciowe, które są wymagane do hybrydyzacji. Elektroforeza służy rozdzieleniu przestrzennemu cząsteczek kwasów nukleinowych według ich ładunku i masy, a więc ich wielkości.
Transfer na membranę W praktyce laboratoryjnej najczęściej wykorzystuje się następujące metody: transfer kapilarny (wykorzystuje on siły kapilarne, jest to najstarsza metoda transferu) transfer próżniowy (wykorzystuje podciśnienie wywołane próżnią przykładaną pod membranę) elektrotransfer (wykorzystuje przepływ ładunków elektrycznych na tej samej zasadzie co elektroforeza).
Utrwalanie próby Po transferze z żelu DNA jest wiązany z membraną przez naświetlanie UV (membrana nylonowa) albo zapieczenie w mikrofalówce lub suszarce (membrana nitrocelulozowa).
Zobacz też Southern blotting Northern blotting Western blotting
Przypisy
Kategoria:DNA