Działalność wystawiennicza w budynku obejmuje ekspozycję stałą oraz wystawy czasowe. 21 stycznia 2023 r. w odnowionym gmachu Muzeum otwarto na nowo zaaranżowaną, stałą wystawę historyczno-etnograficzną i przyrodniczą. Jest to już piąta z kolei stała ekspozycja muzealna urządzona w tym budynku i zarazem siódma w historii Muzeum Tatrzańskiego.
mały|Malarstwo ludowe na szkle, Gmach Główny Muzeum Tatrzańskiego – „przyjęcie Surowca”
Kolekcje Muzeum kolekcjonuje obiekty z zakresu: skał i minerałów, florystyczne (układ piętrowy roślinności Tatr, za gmachem głównym alpinarium Zakładu Ochrony Przyrody PAN) i faunistyczne (głównie ptaków i ssaków, zbiory obejmują ok. 230 gatunków), etnograficzne typowe dla Podhala, Spisza i Orawy (w gmachu głównym prezentowane są sprzęty, ubiór, sztuka zdobnicza i rzeźba, a także pasterstwo górali podtatrzańskich), dzieła sztuki: grafika, malarstwo, malarstwo na szkle, rzeźba i zbiory fotograficzne. Ponadto muzeum gromadzi literaturę tatroznawczą (ok. 30 tys.