Estienne prowadził sekcje i badania anatomiczne razem z poznanym jeszcze na paryskim uniwersytecie chirurgiem Étienne de La Rivière, który wykonywał dla niego rysunki, ale później był z nim w sporze prawnym co do praw do ich głównej pracy De dissection partium corporis humani libri tres, przez co jej wydanie opóźniło się z 1538 do 1545 r., w efekcie czego księga Vesaliusa De Humanae corporis fabrica z 1543 r. zyskała miano pierwszej krytycznej analizy tez Galena. Obaj autorzy posądzali zresztą Vesaliusa o to, że pisał swoją pracę znając już ich książkę. Estienne jest często porównywany do Vesaliusa, jednak jego badania były mniej systematyczne, a czynione ilustracje mniej dokładne i często zapełnione elementami tła jak martwa natura lub pejzaże. Ponadto, mimo licznych słusznych obserwacji, nie odważył się podważyć tez tradycyjnej medycyny, w przeciwieństwie do Vesaliusa.
Estienne był ponadto autorem Dictionarium historicum ad poeticum (1553), będącego pierwszą francuską encyklopedią, Praedium Rusticum (1554), popularnego przez 150 lat traktatu poświęconego rolnictwu, i Thesaurus Ciceronianus (1557).