W 1954 rozpoczął badania laboratoryjne nad seksualnością. Początkowo rekrutował do badań prostytutki. Z czasem jednak uznał, że niemożliwe jest badanie „normalnej” seksualności na podstawie badań prostytutek. Zorganizował 11 letnie badanie z udziałem 382 kobiet i 312 mężczyzn. Badani byli w wieku od 18 do 89 lat. Udział w badaniach był płatny. Dla pomiaru reakcji fizjologicznych używał m.in. elektroencefalografu, elektrokardiografu.
W 1956 roku William Masters nawiązał współpracę z Virginią Johnson, wówczas studentką socjologii. Z początku Johnson pomagała w prowadzeniu wywiadów i wyborze badanych. Wynikiem wspólnych długoletnich badań była książka Human Sexual Response (1966). Książka była trudna w lekturze, wypełniona medyczną terminologią. Wydawca promował ją wyłącznie wśród lekarzy. Mimo to publikacja zyskała ogromny rozgłos. Johnson i Masters rozpoczęli podróże po USA z serią wykładów, na których prezentowali wyniki swoich badań. W książce Masters i Johnson przedstawili model reakcji seksualnej zakładający progresywne następowanie po sobie czterech faz: podniecenia (), plateau (), orgazmu () i odprężenia () (model EPOR).