Na mechanizm działania leku składają się efekt cytostatyczny inhibitora mikrotubul DM1 oraz inhibitora HER2 trastuzumabu.
Trastuzumab wiąże się subdomeną IV zewnątrzkomórkowej części receptora HER2, co uniemożliwia proteolityczne rozszczepienie domeny zewnątrzkomórkowej i przekazywanie sygnału poprzez wpływ na szlak PTEN-PI3K/AKT, co indukuje apoptozę komórki nowotworowej. Ponadto trastuzumab aktywuje cytotoksyczność komórkową zależną od przeciwciał (ADCC).
Połączenie emtanzyny z przeciwciałem skierowanym przeciw HER2 umożliwia selektywne działanie cytostatyku w komórkach nowotworowych wykazujących nadekspresję receptora HER2. Wiązanie trastuzumabu emtanzyny z receptorem HER2 powoduje transport kompleksu HER2-T-DM1 poprzez endocytozę. Wówczas w lizosomie komórki dochodzi do enzymatycznej proteolizy stabilnego w krążeniu i mikrośrodowisku guza łącznika, w wyniku czego dochodzi do uwolnienia cytostatyku w obrębie komórki nowotworowej. Ogólnie DM1 wykazuje podobne działanie jak alkoloidy Vinca (alkaloidy barwinka różyczkowego). Choć lek w badaniach in vitro wykazuje silniejsze działanie cytotoksyczne niż alkaloidy barwinka różyczkowego czy taksany, to znaczna toksyczność leku i wąski indeks terapeutyczny ograniczały jego kliniczne wykorzystanie aż do czasu opracowania koniugatów leków i swoistych przeciwciał monoklonalnych.