W XVI i XVII w. do Guanajuato napływali liczni osadnicy, co było związane z odkryciem złóż srebra. W 1557 r. założone zostało miasto Guanajuato, dwa lata później powstało San Miguel. W 1574 r. założone zostało León. Ta wzrastająca ekspansja hiszpańska wiązała się ze wzrostem zamożności tych terenów i zapotrzebowaniem na nowe kadry przy pracy w kopalniach. W 1762 r. do prowincji przybywa pierwszy przedstawiciel inkwizycji, która za swój cel obiera nielicznych jeszcze tutaj protestantów i przedstawicieli innych religii. W 1767 r. dochodzi do konfliktu związanego z wyrzuceniem jezuitów z Guanajuato.
Guanajuato odegrało ważną rolę w uzyskaniu niepodległości przez Meksyk. To w tej prowincji, a dokładniej w mieście Dolores swoją działalność rozpoczął przywódca ruchu powstańczego – ksiądz Miguel Hidalgo. Hidalgo podburzał chłopów do wystąpienia przeciwko Koronie Hiszpańskiej. Hidalgo po zorganizowaniu armii doszedł do stolicy kolonii, ale zrezygnował z jej zdobywania, a następnie został pokonany przez siły rojalistyczne. Guanajuato dołączyło do Federacji Meksykańskiej po oficjalnym uzyskaniu suwerenności przez ten kraj w 1821 r.