W 1. połowie XII wieku, ok. roku 1134, najprawdopodobniej z okazji ślubu księcia Konrada II Znojemskiego z Marią (córką żupana serbskiego – Urosza I Wukanowicza), rotunda została przebudowana. Zmieniono wtedy patronkę na św. Katarzynę, a wnętrze pokryto romańskimi freskami.
Rotunda św. Katarzyny pełniła funkcję kaplicy zamkowej. Podczas prac konserwatorskich prowadzonych przez Františka Fišera w 1947 r. odkryto wyryty w tynku łaciński napis z XIII wieku. Ze względu na częściowe uszkodzenie napisu oraz powszechną praktykę pomijania dźwięków interpretacja napisu nie jest jednoznaczna. Jednak zgodnie z przeważającą interpretacją podaje się, że w 1134 roku książę Konrad II Znojemski zmodyfikował statut sanktuarium maryjnego i poświęcił je św. Katarzynie. Inskrypcja ta jest jedynym pisemnym dowodem pierwotnego rozważanego poświęcenia rotundy Najświętszej Marii Pannie.
Po podniesieniu Znojma do rangi miasta, budowlę w 1226 roku podporządkowano kościołowi farnemu św. Mikołaja. Od 1287 roku był to kościół filialny kościoła parafialnego św. Michała, który wraz z rotundą został w 1320 roku przekazany klasztorowi sióstr św. Klary przez Henryka z Lipy. W 1551 r. plebania przy kościele św. Michała została przejęta przez miasto, któremu w 1555 r. klaryski sprzedały rotundę.