projektowanie sondy: nie może obejmować innych miejsc polimorficznych, musi mieć odpowiednią długość oraz zawartość GC; projektowanie warunków hybrydyzacji: warunki hybrydyzacji muszą być wystarczająco ścisłe, aby umożliwić związanie sondy w pełni komplementarnej, a jednocześnie odpłukanie sondy, która ma zaledwie jeden niekomplementarny nukleotyd; konieczność wyboru pomiędzy badaniem dużej liczby próbek a badaniem dużej liczby alleli; analiza wyłącznie znanych mutacji.
Zastosowanie Generalnie PCR/ASO wykorzystywane jest w badaniach przesiewowych pod kątem znanych mutacji, m.in.:
diagnostyka anemii sierpowatej (analiza genu β-globiny), diagnostyka nowotworów, diagnostyka α-talasemii, β-talasemii, diagnostyka mukowiscydozy (analiza genu CFTR).
Ciekawostki Istnieje procedura pozwalająca na przeprowadzenie hybrydyzacji w stopniowo opadającej temperaturze (75-30 °C), co zmniejsza nakład pracy przy optymalizacji procesu; polega ona na dodaniu do roztworu ze znakowaną sondą nieznakowanej sondy specyficznej dla innego allelu - konkuruje ona o związanie się z komplementarną próbką, co zapobiega powstawaniu niespecyficznych hybryd. Sondy ASO mogą być wykorzystane jako startery w reakcji PCR. PCR-ASO może być łączone z RFLP.
Przypisy
Kategoria:Biologia molekularna