Pierwszym oficerem na Enterprise był Wolkan Spock, głównym oficerem medycznym doktor Leonard H. McCoy, a głównym mechanikiem Montgomery Scott. Oprócz tego w skład załogi wchodzili m.in. sternik Hikaru Sulu, nawigator Pavel Chekov i oficer komunikacyjny Uhura.
„Pięcioletnia misja...” Pod dowództwem kapitana Kirka Enterprise przetrwał wiele niebezpiecznych sytuacji, włączając w to starcie z Romulanami, wiele potyczek z Klingonami, mobilnymi platformami bojowymi zdolnymi do zniszczenia całych układów gwiezdnych, a także spotkania z przedstawicielami potężnych ras zdolnych w mgnieniu oka zniszczyć cały okręt wraz z załogą. Kirk niejednokrotnie musiał walczyć o utrzymanie kontroli nad Enterprise, jednak dzięki swoim zdolnościom i pomocy załogi wychodził zwycięsko z opresji.
Modernizacja Paradoksalnie, sukces Kirka doprowadził do jego porażki, bowiem po ukończeniu pięcioletniej misji badawczej został on w uznaniu swoich zasług awansowany do stopnia admirała, co zmusiło go do rozstania ze swoim ukochanym okrętem, zaś sam Enterprise został mu odebrany i poddany intensywnej modernizacji trwającej półtora roku.