Przełom w dziejach ulicy nastąpił po rozpoczęciu w roku 1568 – z fundacji Zygmunta Augusta – budowy stałego mostu na Wiśle, zwanego mostem Zygmunta Augusta. Budowę drewnianego mostu ukończono już po śmierci króla, w roku 1573, dzięki zabiegom Anny Jagiellonki. W latach 1581–1582 z fundacji Anny Jagiellonki wzniesiono przy moście murowaną strażniczą wieżę bramną – Bramę Mostową. Dzięki istnieniu mostu ulica Mostowa otrzymała (poza nazwą) częściowo brukowaną nawierzchnię, ułożoną w roku 1595.

Drewniany most Zygmunta Augusta przetrwał 30 lat, do roku 1603, kiedy to został zniesiony przez krę; ulica Mostowa wówczas na powrót stała się dojazdem do zwykłej przeprawy na Wiśle.

Pod koniec XVI wieku Bractwo Miłosierdzia założone w roku 1584 przez Piotra Skargę otworzyło przy Mostowej szpital św. Łazarza dla ubogiej, okolicznej ludności. Zabudowania, pierwotnie drewniane i zastąpione około roku 1621 murowanymi, kilkakrotnie powiększano i nadbudowano do wysokości dwóch pięter;