Wszystkie fragmenty, we wszystkich wariantach doświadczenia, zaczynają się takim samym odcinkiem - starterem – krótkim odcinkiem oligonukleotydowym pozwalającym polimerazie na rozpoczęcie wydłużania łańcucha, dodanym na początku reakcji wraz z pozostałymi substratami. Jak wynika z powyższego, warunkiem odczytania sekwencji DNA, być może dość długiej, liczącej np. 400 - 600 nukleotydów jest wcześniejsze poznanie niewielkiego jej fragmentu (w idealnych warunkach mającego długość około 20 nukleotydów), tak by można było przygotować starter odpowiedni do tej matrycy. Problem ten jest często rozwiązywany w ten sposób, że badane, nieznane DNA wbudowuje się (przy pomocy enzymu ligazy) do pomocniczej cząsteczki DNA o znanej sekwencji, zwanej wektorem klonującym czy wektorem do klonowania DNA (genów). Przystępując do sekwencjonowania, dobiera się starter komplementarny wobec fragmentu wektora (znanego) sąsiadującego z nieznanym, badanym fragmentem DNA. thumb|350px|Schemat obrazujący ideę sekwencjonowania metodą Sangera Ponieważ każda z czterech probówek zawiera miliony cząsteczek analizowanego DNA i każda z tych cząsteczek ulega kopiowaniu, to zgodnie z prawem wielkich liczb w probówkach tych pojawiają się łańcuchy o wszelkich możliwych długościach (zależnych od sekwencji matrycy).