Kluby z 28 najlepszych federacji według współczynników krajowych UEFA z 2024 zakwalifikowali się do drugiej rundy, a pozostałe 24 drużyny rozpoczeły od pierwszej rundy. Jeśli młodzi mistrzowie krajowi zakwalifikowali się do ścieżki Ligi Mistrzów UEFA, ich miejsce zajęli młodzi wicemistrzowie krajowi. Jeśli wicemistrzowie zakwalifikowali się również do ścieżki Ligi Mistrzów UEFA, wakat nie został zlikwidowany. W turnieju zadebiutowały drużyny Aberdeen, , Aston Villa, Auxerre, Bologna, AP Brera Strumica, Brest, Budućnost Podgorica, Bylis Ballsh, Cliftonville, CSKA Sofia, 2 Korriku Prisztina, FC Santa Coloma, Girona, HB Tórshavn, IFK Göteborg, IMT, Lincoln Red Imps, Progrès Niedercorn, Rapid Wiedeń, Real Betis, Sabah Baku, Sassuolo, Strømsgodset, Sturm Graz, VfB Stuttgart, Tallinna Kalev, The New Saints, Valletta i Zbrojovka Brno.