Vespucci pracował też dla króla Portugalii. W latach 1501–1502 pełnił funkcję kosmografa podczas portugalskiej wyprawy do wschodnich wybrzeży Ameryki Południowej, od ujścia Magdaleny do Bahía Blanca. Zbadał znaczną część wschodniego wybrzeża Ameryki Południowej. Opisał odkrycie rzek Rio de Janeiro i Rio de la Plata oraz Patagonii i Georgii Południowej. To właśnie podczas tej podróży Amerigo – w odróżnieniu od Krzysztofa Kolumba, który sądził, że dotarł do Indii – uznał odwiedzone tereny za nieznany wcześniej Europejczykom kontynent. Od 1503 zaczęły się ukazywać drukiem listy Vespucciego wraz z barwnymi opisami poznanych krajów. Tłumaczone na wiele języków, zyskały mu tak dużą popularność, iż powszechnie jego, a nie Kolumba, zaczęto uważać za odkrywcę Ameryki, a nowy ląd nazwano od jego imienia.
Nie jest wiadome, ile razy Vespucci przemierzał Atlantyk, nawet jego własne relacje są niejednoznaczne. Relacje z jego wypraw zawarte w listach do przyjaciół różniły się między sobą, a dane co do długości i szerokości geograficznych nie zawsze były zgodne z prawdą. W pierwszą podróż udał się prawdopodobnie w 1497 roku.