Rozpoznanie CDI opiera się na współwystępowaniu objawów (zwłaszcza biegunki) oraz potwierdzeniu laboratoryjnym obecności toksynotwórczej C. difficile lub jej toksyn w próbce kału. W diagnostyce podkreśla się różnicę pomiędzy dodatnim wynikiem u osoby bez objawów (kolonizacja) a objawowym zakażeniem wymagającym leczenia.
Do wykrywania toksyn stosuje się (EIA) wykrywające toksynę A i/lub B oraz test cytotoksyczności (CCNA), uznawany za „złoty standard” wykrywania wolnych toksyn w kale. EIA cechuje krótki czas wykonania, ale mniejsza czułość i umiarkowana swoistość, a starsze testy wykrywające wyłącznie toksynę A mogą prowadzić do pomijania części zakażeń wywołanych szczepami wytwarzającymi tylko toksynę B, dlatego ich stosowanie opisywano jako niezalecane. CCNA wykazuje wysoką czułość i swoistość, jednak jest metodą czaso- i pracochłonną, niewystandaryzowaną i zależną od wykonującego badanie, co ogranicza jej użyteczność w rutynowej diagnostyce.
Do metod wykrywania toksynotwórczych szczepów (a nie wolnych toksyn) zalicza się m.in. wykrywanie dehydrogenazy glutaminianowej (GDH) oraz testy molekularne NAAT (np. PCR).