W tym samym roku Priestley przeniósł się do Calne w Wiltshire, gdzie został bibliotekarzem i nauczycielem Williama Petty'ego, earla of Shelburne i jego rodziny. W tym czasie wynajdował również nowe dowody na poparcie swojej nowej wiary w życzliwego Boga unitariańskiego zamiast mściwego kalwińskiego Boga, w którego wierzył w młodości. Jednocześnie, obserwując proces wegetacji i zmiany poziomu mórz i jezior, Priestley zaczął tworzyć teorię obiegu powietrza w przyrodzie. Obserwacje te przyczyniły się do wsparcia współczesnych mu badań fotosyntezy prowadzonych przez Jana Ingenhousza i Jeana Senebiera.
Priestley odkrył i wyizolował tlen, gdy 1 sierpnia 1774 r. ogrzewał tlenek rtęci. Zaobserwował również, że pod wpływem tego gazu możliwe jest palenie się płomienia świecy i utrzymanie myszy przy życiu i na tej podstawie nazwał odkryty gaz powietrzem pozbawionym flogistonu, co było zgodne z ówczesnym przekonaniem, że powietrze nasycone flogistonem będzie niezdatne do podtrzymywania życia. Jednocześnie Priestley nie był przekonany, że odkrył nowy rodzaj powietrza. Jeszcze tego samego roku udał się w towarzystwie Shelburne'a w podróż po Niderlandach, Niemczech i Francji, podczas której spotkał w Paryżu Antoine'a Lavoisiera.