Ważną funkcją wakuoli u roślin jest jej udział w obronie przed fitofagami i patogenicznymi mikroorganizmami. Wewnątrz wakuoli gromadzone są substancje zaliczane do metabolitów wtórnych, które na różny sposób mogą zaburzać metabolizm, procesy trawienne lub rozwój roślinożerców. Fitoantycypiny mogą być także repelentem, związkiem który zniechęca roślinożerców nadając tkankom roślinnym nieatrakcyjny smak lub zapach. Infekcjom mogą zapobiegać gromadzone w wakuolach białka obronne takie jak chitynaza albo lizozym. Dotychczas poznano kilkadziesiąt tysięcy związków obronnych wytwarzanych przez komórki roślinne.
W niektórych wakuolach gromadzone są związki nieszkodliwe dla zwierząt, pełniące funkcję atraktanów. Przywabiają one zwierzęta zapylające oraz uczestniczące w rozsiewaniu nasion.
W komórkach epidermy wakuola jest zaangażowana w odbiór bodźców, zapewniając roślinie możliwość reakcji o charakterze grawitropizmu. Wewnątrz tonoplastu tych komórek znajdują się amyloplasty przemieszczające się zgodnie z siła grawitacji. U mutanta Arabidopsis thaliana, w którego komórkach amyloplasty znajdowały się na zewnątrz wakuoli, reakcja grawitropowa jest zaburzona.
Magazynują substancje, które mogłyby działać szkodliwie np.