Relacje między Marią a Henrykiem popsuły się pod koniec lat 20. XVI w., kiedy Maria sprzeciwiła się rozwodowi brata z jego pierwszą żoną, Katarzyną Aragońską. Maria i Katarzyna znały się już od 1501 r., wtedy bowiem Katarzyna przybyła do Anglii aby poślubić Artura Tudora, najstarszego brata Marii. Obie przez całe życie miały bardzo dobre kontakty.
Trzymając stronę Katarzyny, Maria ostentacyjnie okazywała niechęć kochance Henryka, Annie Boleyn. W 1532 r. publicznie wyraziła kilka obraźliwych komentarzy na temat romansu swego brata, co wywołało bójkę w prezbiterium Opactwa Westminsterskiego pomiędzy zwolennikami rodziny Boleyn'ów a dworzanami męża Marii i zakończyło się śmiercią jednego z nich. Po tym wydarzeniu Maria wraz z Karolem wycofali się z życia dworskiego i przenieśli się do swej rezydencji w Oxfordshire.
Król próbował przekonać Marię do akceptacji swej decyzji o anulowaniu swego dotychczasowego małżeństwa i poślubieniu swojej kochanki, jednak księżna Suffolk konsekwentnie odmawiała uznania Anny Boleyn. Nie pojawiła się na spotkaniu w Calais, gdzie Henryk VIII oficjalnie zaprezentował królowi Francji Franciszkowi I Annę jako swoją przyszłą żonę. Nieobecność Marii była szeroko komentowana.