Okres luterański thumb|Widok Gdańska na sztychu z 1628 r. Kilkanaście lat po ukończeniu prac budowlanych, zapoczątkowana w 1517 roku reformacja dotarła do Gdańska. W 1529 r. odbyło się w gdańskiej farze pierwsze nabożeństwo protestanckie, ale do 1572 r. główny ołtarz służył katolikom, którzy ponownie przejęli kościół dopiero po 1945 roku. Choć przez kolejne stulecia kościół służył gminie luterańskiej, do drugiej połowy XVII wieku proboszczami kościoła byli katoliccy duchowni wyznaczeni przez króla polskiego. W XVII wieku, obok kościoła Mariackiego, powstała kaplica Królewska w celu odprawiania nabożeństw dla gdańskich katolików. Zgodnie z doktrynami Marcina Lutra zachowano w znacznym stopniu dawny średniowieczny wystrój, jednakże ściany pokryte polichromiami zostały pobielone. Poprzez wzniesienie nowych organów, chrzcielnicy i ambony zaakcentowano nową przestrzeń liturgiczną wewnątrz świątyni. Patronat nad świątynią sprawował gdański patrycjat, który uposażył kościół licznymi dziełami sztuki, których większość zawierała bogate treści ideowe wyrażające potęgę gdańszczan.