Kariotyp wynosi 2n = 42–44, FNa = 48–50 oraz FN = 52–54.
Ekologia Często lata już o zmierzchu; chętnie żyje w pobliżu osiedli ludzkich; typowo szczelinowy gatunek; samice tworzą kolonie letnie liczące do 50–500 osobników pod okapami, w szczelinach murów lub belek nośnych, w pustych drzewach lub pod korą; zimują w zakamarkach budynków, na wieżach, za obrazami w kościołach, na południu w jaskiniach o temperaturze 2–8 °C.
Jedno z największych zimowisk karlika malutkiego w Środkowej Europie znajduje się w rumuńskiej jaskini Șura Mare. W roku 2002 stwierdzono tam zimowanie 32-34 tysięcy osobników tego gatunku. Wcześniej, w latach 60., rejestrowano tam nawet ponad 100 tysięcy osobników. Innym wielkim zimowiskiem tego gatunku jest słowacka jaskinia Erňa w Krasie Słowacko-Węgierskim. W latach 2000-2001 stwierdzono tu zimowania 35-45 tysięcy karlików malutkich w skupiskach nawet po 5-8 tysięcy osobników.
Rozmnażanie
Wiosną samice tworzą kolonie w kryjówkach rozrodczych. Ciąża trwa około 5 tygodni, w jednym miocie jest 1–2 młode. Małe karliki rodzą się nagie i ślepe. Ważą wtedy około 1 grama. Rosną bardzo szybko i już w trzecim tygodniu startują do swojego pierwszego lotu. Początkowo uczą się łapania owadów w towarzystwie matki, ale ssą mleko matki do 2.