Twarz św. Anny ma kolor bursztynowy, oblicze Dziewicy jest przeźroczyste, a Dzieciątko pozostaje w cieniu. Św. Anna spogląda z wpół przymkniętych powiek. Jej czoło jest szerokie, oczodoły niemal prostokątne. Uśmiech św. Anny wyraża apoteozę miłości macierzyńskiej, spokojne szczęście, czułość, pobłażliwość. W przeciwieństwie do uśmiechu Mony Lisy, uśmiech św. Anny nie wywołuje niepokoju. Zdaniem Giuseppina Fumagalliego uśmiech na obrazie jest pierwszym (obok Mony Lisy i Świętego Jana Chrzciciela) uśmiechem typowo leonardowskim. Podobieństwo do uśmiechu Mona Lisy dostrzega również Antonina Vallentin.
Maria wyciąga prawą rękę w łagodnym i opiekuńczym geście. Dzieciątko za wszelką cenę zarzuca nóżkę na kark baranka. Na obrazie widać trzy stopy kobiecie. Zostały przedstawione w taki sposób, że patrzącemu ciężko jest rozróżnić, która należy do św. Anny, a która do Marii.