Pierwszy pal w dno Wisły wbito 25 czerwca 1568. Budową kierował Erazm Giotto z Zakroczymia, nadzór sprawował kasztelan czerski i starosta warszawski Zygmunt Wolski. Ksiądz Kasper Sadłocha, kanonik warszawski i sekretarz królewski, odpowiadał za sprawy finansowe. Budowa kosztowała 100 tys. florenów. Podczas budowy pale te wbijano w dno rzeki dębowymi kafarami okutymi żelazem zainstalowanymi na pływających na rzece tratwach. W 1572 po niewykończonym jeszcze moście przeprawił się król Zygmunt August.

Po śmierci króla budową zajęła się Anna Jagiellonka, w dużej mierze sumptem własnych środków. Głównie dzięki niej budowa mostu została zakończona. Most został otwarty dla ruchu 5 kwietnia 1573, a następnego dnia ogłoszono regulamin poruszania się po nowej przeprawie. W 1582 oddano do użytku dwupiętrową Bramę Mostową, odgradzającą most od drewnianych zabudowań miasta (dla ochrony przed pożarem). W bramie stacjonowała straż złożona z 50 ludzi.

Po praskiej stronie Wisły nie było podobnej Bramy, a wjazd na most znajdował się w rejonie wylotu dzisiejszej ulicy Ratuszowej.

O moście w 1595 roku wspomniał przebywający w Polsce Paulo Mucante, sekretarz kardynała Henryka Gaetano.