Tymczasem Henryk wciąż starał się o męskiego dziedzica, ale z biegiem czasu stawało się jasne, że królowa Katarzyna nie będzie już mogła mieć dzieci. Wtedy królowi wpadła w oko Anna Boleyn, siostra jednej z poprzednich kochanek króla, Marii Boleyn. Król zdecydował się poślubić Annę. Ponieważ rozwód z Katarzyną – ze względu na naukę katolicką o nierozerwalności małżeństwa – był niemożliwy, Henryk próbował uzyskać od papieża Klemensa VII orzeczenie o nieważności ślubu. Powoływał się na fakt, że była ona wcześniej żoną jego starszego brata Artura. Papież był jednak nieugięty, uznając, że nie ma podstaw do uznania kanonicznej nieważności związku zawartego jako sakrament. W tym rozstrzygnięciu wspierał go moralnie siostrzeniec Katarzyny, cesarz Karol V.
W 1533 Henryk poślubił w sekrecie Annę Boleyn. Niedługo potem arcybiskup Canterbury Tomasz Cranmer ogłosił unieważnienie małżeństwa Henryka z Katarzyną. Papież unieważnienia nie uznał, co doprowadziło w 1534 do zerwania z Rzymem i powstania Kościoła anglikańskiego.
Katarzyna utraciła tytuł królowej Anglii i stała się księżną wdową Walii. Maria została uznana za dziecko nieślubne, usunięta z dworu i wykluczona z sukcesji do tronu.