Darnley, ojciec Jakuba został uduszony w nocy 9/10 lutego 1567 r. Okoliczności zabójstwa pozostają niewyjaśnione. Najczęściej oskarża się Marię o to, że chciała pozbyć się męża. O morderstwo posądzano również Jamesa Hepburna, 4. hrabiego Bothwell, który niedługo po śmierci Darnleya poślubił młodą wdowę, co zostało źle odebrane zarówno przez Szkotów, jak i przez dwory europejskie. Możliwe jest również, że zabójstwa dokonała protestancka opozycja, wiedząc, że odpowie za nie nielubiana królowa. Rzeczywiście, śmierć Darnleya i pośpieszne kolejne małżeństwo Marii przyczyniły się do spadku popularności królowej i wybuchu rebelii. W czerwcu Maria została aresztowana, osadzona w Loch Leven Castle i zmuszona do abdykacji (24 lipca) na rzecz małego syna, który w tym momencie stał się królem Jakubem VI.
Okres regencji 29 lipca 1567 r. w Church of the Holy Rude w Stirling Jakub został koronowany na króla Szkocji. Baronowie postanowili wychować Jakuba w religii protestanckiej – jego wychowawcy musieli być sympatykami prezbiterianizmu. Pierwszym nauczycielem młodego króla został historyk i poeta George Buchanan. Na czas małoletności króla koniecznością stało się ustanowienie funkcji regenta – pierwszym został przyrodni brat obalonej królowej, James Stewart, 1.