W drugim etapie aldehyd 3-fosfoglicerynowy zostaje utleniony do 1,3-bisfosfoglicerynianu. Reakcję tę katalizuje dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego [EC 1.2.1.12]. Energia wyzwolona podczas utleniania aldehydu 3-fosfoglicerynowego wystarcza do zredukowania cząsteczki NAD+ do NADH oraz ufosforylowania powstającego kwasu 1,3-bisfosfoglicerynowego przez przyłączenie fosforanu nieorganicznego. Fosfodihydroksyaceton także wchodzi w opisaną reakcję, po odwracalnym przekształceniu do aldehydu 3-fosfoglicerynowego przez izomerazę triozofosforanową [EC 5.3.1.1]. Kwas 1,3-bisfosfoglicerynowy traci jedną z grup fosforanowych, przekazując ją na ADP. Reakcję przeniesienia fosforanu na ADP przeprowadza kinaza fosfoglicerynianowa [EC 2.7.2.3], co prowadzi do powstania cząsteczki ATP (fosforylacja substratowa) oraz 3-fosfoglicerynianu. Związek ten może być łatwo przekształcony do 2-fosfoglicerynianu w odwracalnej reakcji katalizowanej przez mutazę fosfoglicerynianu [EC 5.4.2.1]. 2-fosfoglicerynian w kolejnej odwracalnej reakcji zostaje przekształcony w fosfoenolopirogronian (PEP) przez enolazę [EC 4.2.1.11], która odłącza cząsteczkę wody.