Okres II wojny światowej thumb|Ul. Dworcowa, kamień poświęcony ofiarom nalotu niemieckiego lotnictwa na cywilny pociąg ewakuacyjny w dniu 2 września 1939 r. 2 września 1939 roku na dworcu kolejowym w Kole doszło do nalotu na pociąg ewakuacyjny z Krotoszyna, w wyniku którego zginęło od 100 do 300 osób.

Okupacja hitlerowska trwała w mieście od 3 września 1939 do 23 stycznia 1945. Krotoszyński 56 Pułk Piechoty Wielkopolskiej wsławił się w 1939 roku obroną położonego blisko granicy Krotoszyna oraz obroną Warszawy, o czym wspomniał w pożegnalnym rozkazie generał Juliusz Rómmel.

Od września do końca roku w mieście działała niemiecka grupa operacyjna Einsatzgruppe VI prowadząca czystki etniczne w ramach akcji T4, Intelligenzaktion oraz operacji Tannenberg.

W czasie II wojny światowej w latach 1939–1941 z miasta wysiedlono większość Polaków do Generalnego Gubernatorstwa, a w zamian sprowadzono Niemców w ramach akcji Heim ins Reich.