Spektrum przeciwbakteryjne i zastosowanie Aminoglikozydy działają na: bakterie Gram-ujemne, zwłaszcza pałeczki duru, czerwonki, okrężnicy (Escherichia coli), krztuśca, tularemii, ropy błękitnej (Pseudomonas aeruginosa) i innych (nie działają na bakterie z rodzaju Haemophilus); prątki gruźlicy (najwyższą aktywność ma streptomycyna); gronkowce (tylko niektóre preparaty); paciorkowce (synergizm z β-laktamami poprzez zwiększenie ich przepuszczalności), np. leczenie zapalenia wsierdzia. Nie wszystkie antybiotyki tej grupy wykazują identyczną aktywność wobec określonych szczepów bakteryjnych.
Streptomycyna i kanamycyna nie są obecnie wykorzystywane do leczenia infekcji szczepami bakterii Gram-ujemnych, oporność wobec pozostałych przedstawicieli tej grupy jest zróżnicowana. Najwięcej szczepów opornych stwierdza się na gentamycynę i tobramycynę, a najmniej na amikacynę.
Aminoglikozydy, ze względu na dużą siłę działania, ale też znaczną toksyczność, stosuje się do leczenia ciężkich zakażeń.