Brat aktora Ruggero pracował jako kelner w hotelu „Ludovisi”, gdzie mieszkali alianccy oficerowie. Dzięki temu w tych trudnych czasach rodzinie Mastroiannich powodziło się lepiej niż przed wojną. Natomiast Marcello po powrocie do Rzymu zatrudnił się jako księgowy w angielskiej spółce filmowej Eagle Lion Film.
W 1948 zadebiutował w filmie I miserabili.
Życie prywatne 12 sierpnia 1950 zawarł związek małżeński z włoską aktorką Florą Carabellą, z którą miał córkę Barbarę (ur. 2 grudnia 1951, zm. 11 października 2018). W 1964 doszło do separacji. Był związany z Faye Dunaway (1968–1970) i Catherine Deneuve (1970–1974), z którą miał córkę Chiarę (ur. 28 maja 1972). Od 1976 aż do śmierci jego partnerką była włoska reżyserka Anna Maria Tatò.
Filmografia
Nagrody Dwa razy zdobył nagrodę za pierwszoplanową rolę męską – za rolę Oreste Nardiego w komediodramacie Ettorego Scoli Dramat zazdrości (Dramma della gelosia (tutti i particolari in cronaca), 1970) na 23. Festiwalu Filmowym w Cannes i jako Romano Patroni w melodramacie Nikity Michałkowa Oczy czarne (Oci ciornie, 1987) na 40. festiwalu w Cannes.