Ze względu na niewielką odległość puszczy od Krakowa od XIII do XVIII wieku była jednym z najpopularniejszych obszarów polowań władców Polski.
Pierwsza informacja o puszczy pochodzi z dokumentu z 1242 r., kiedy to nazywano ją Las Kłaj. W 1393 r. występuje pod nazwą Las Niepołomicki, a w 1441 r. użyto po raz pierwszy nazwy Puszcza Niepołomicka. Puszcza była własnością najpierw królów Polski (XIII – XVII w.), a po rozbiorach przeszła na własność skarbu państwa.
Drogą zwaną Królewską Drogą udawali się na polowania w głąb puszczy najwięksi królowie. Polowano wtedy na grubą zwierzynę: niedźwiedzie, tury, żubry i inne. Puszcza też dostarczała drewna, a opiekę nad nią sprawowali wyznaczeni przez starostwo niepołomickie łowczy i leśniczy. Wykonane w 2021 roku badania dendrochronologicznych drewna dębowego konstrukcji ołtarza Wita Stwosza ustaliły, że 130-letnie dęby pochodziły z Puszczy Niepołomickiej i rosły w latach 1350–1472.