W październiku 2005 w wyniku prawyborów, w których otrzymał ponad 74% głosów, został liderem Unii, szerokiej koalicji skupiającej ugrupowania centrowe, centrolewicowe i komunistyczne, pozostające w opozycji do centroprawicy Silvia Berlusconiego. Blok ten zwyciężył w wyborach parlamentarnych w 2006, uzyskując dzięki nowej ordynacji stabilną większość w Izbie Deputowanych i jednocześnie minimalną większość w Senacie. Romano Prodi uzyskał wówczas mandat posła XV kadencji. 17 maja 2006 po raz drugi stanął na czele rządu. Brak spójności między licznymi koalicjantami powodował kolejne kryzysy polityczne. W lutym 2007, po przegranym głosowaniu dotyczącym polityki zagranicznej, Romano Prodi podał się do dymisji. Po kilku dniach kryzys rządowy został zażegnany, a rząd uzyskał wotum zaufania w obu izbach.