Cechy te sprawiły, iż dowódca RAF Bomber Command Arthur Harris nie wyraził zgody na inne użycie tej maszyny (np. holowanie szybowców transportowych) niż loty na bombardowanie celów strategicznych wewnątrz Niemiec. Najwyższe osiągi miała wersja Mk. II z uwagi na moc zastosowanych silników gwiazdowych.
Użycie Samoloty Lancaster weszły na uzbrojenie lotnictwa brytyjskiego począwszy od grudnia 1941 roku. W nowe maszyny jako pierwszy wyposażono stacjonujący w . Cztery Lancastery trafiły tam w wigilię Bożego Narodzenia 1941 roku. Lancaster z tego dywizjonu 3 marca 1942 roku wykonał misję, w trakcie której zaminował niemiecki szlak żeglugowy w pobliżu wyspy Helgoland. Zgodnie z brytyjską doktryną, Lancaster był przede wszystkim bombowcem nocnym. Pierwszy lot bojowy 2 Lancastery wykonały w nocy 17 kwietnia 1942 roku podczas nalotu na Essen. Następnie bywały używane masowo w kolejnych nocnych nalotach RAF-u na niemieckie miasta i zakłady przemysłowe.