Służba Pierwsze Do-24 trafiły do Luftwaffe w kwietniu 1940. Używane były do lotów rozpoznawczych, patrolowych, transportowych i innych, ale najbardziej zasłużyły się w roli maszyn ratowniczych. Podczas II wojny samoloty po wodowaniu zabrały na pokłady ponad 12000 rozbitków. Jako transportowiec mógł zabrać 24 żołnierzy z 30 kg oporządzenia. Znany jest przypadek ewakuowania 40 żołnierzy z niesprawnym jednym z trzech silników. Latały praktycznie nad wszystkimi akwenami, na i nad którymi operowały siły niemieckie: Atlantykiem, Morzem Północnym, Morzem Arktycznym, Morzem Śródziemnym, Bałtykiem, Morzem Czarnym. W początkowym okresie wojny samoloty intensywnie latały nad kanałem La Manche. Dornier wykazywał znakomitą dzielność morską, dzięki czemu możliwe było wodowanie na dość wzburzonym morzu i start z rozbitkami (fale o wysokości do 1 m).
Łodzie latające Do-24 trafiły też do służby w innych państwach, między innymi w Australii (6 egzemplarzy pod oznaczeniem A-49), Francji (zbudowano na licencji 20 egz.