Spośród sygnałów kostymulujących kluczową rolę odgrywa oddziaływanie CD28 z CD80/CD86. Już w 2000 roku zidentyfikowano szlaki inicjowane przez CD28 jako jeden z pierwszych sygnałów niezbędnych do wytwarzania komórek Treg. Prawdopodobnie sygnał biegnący od CD28 może rekompensować lub całkowicie zastępować brak sygnału cytokin, szczególnie IL-2. Rola CD28 polega na wzmacnianiu sygnału biegnącego od TCR. Jest to zbieżne z obserwacjami dotyczącymi wysokiego powinowactwa TCR komórek nTreg do autoantygenów, bowiem stymulacja poprzez CD28 wzmacnia sygnał TCR. Innymi cząsteczkami kostymulatorowymi, które zdają się odgrywać rolę w rozwoju grasiczych limfocytów Treg, są CD154 oraz CD27.
Elementami komórkowymi środowiska grasicy stymulującymi rozwój limfocytów Treg są komórki nabłonkowe rdzenia grasicy (mTEC) wykazujące ekspresję czynnika transkrypcyjnego AIRE oraz komórki dendrytyczne.