Zjawisku całkowitego wewnętrznego odbicia towarzyszy powstanie fali zanikającej (wiąże się to z różnicą między współczynnikiem załamania światła szkła, czy kwarcu i wody, czyli próbki – współczynnik ten dla szkła (kwarcu) jest większy), która nie ulega odbiciu, ale penetruje środowisko (próbkę) po drugiej stronie szkiełka lub pryzmatu. Czyni to jednak tylko na pewną określoną głębokość (fala ta zanika wykładniczo wraz z odległością), co w praktyce oznacza zwykle około 100-200nm. W tym obszarze głębokości próbki, fala ta może wzbudzić obecne w próbce fluorofory, a one zaczną emitować światło (co ważne, fala zanikająca ma tę samą długość co fala, która uległa odbiciu). To emitowane światło jest następnie odbierane przez obiektyw, przepuszczane przez stosowne filtry i przetwarzane jak w klasycznym mikroskopie fluorescencyjnym.
W ten sposób w TIRFM następuje bardzo selektywna wizualizacja obszarów położonych zaraz pod szkiełkiem lub pryzmatem (może to być błona nakrytej nim komórki), ponieważ obszar wzbudzenia powstaje tylko w zasięgu fali zanikającej, co znacznie ogranicza wpływ tła (wnętrza komórki). Znacznie powiększa to rozdzielczość uzyskanych obrazów.
Rozdzielczość ta bywa tak znaczna, że technika TIRFM pozwala na wizualizowanie pojedynczych cząsteczek fluoroforu.
Linki zewnętrzne Glowing molecules can be distinguished one at a time – Nature.com
Kategoria:Mikroskopy Kategoria:Fluorescencja