Mimo wszystko, na samym początku rządów Zygmunta III, Zamoyski, który wiernie służył królom Rzeczypospolitej, dołączył do opozycjonistów walczących z polityką Zygmunta III, chcącego wzmocnić władzę królewską i przeobrazić Rzeczpospolitą w monarchię absolutną poprzez przymierze z Habsburgami w celu zapewnienia sobie ich pomocy w odzyskaniu szwedzkiego tronu. Nowy król obawiał się wpływów kanclerza, a zgodnie z prawem Rzeczypospolitej nie był w stanie odwołać go ze stanowiska. Z kolei Zamoyski traktował króla jak pionka w grze i ignoranckiego obcokrajowca. Jako przeciwnik króla przestrzegał przed niepotrzebną ingerencją Rzeczypospolitej w wojny dynastyczne w Szwecji, zwłaszcza że ciągle istniało zagrożenie ze strony Imperium osmańskiego. Jego polityka i działania przeciwstawiały się (lub ewentualnie próbowały uniknąć) tendencjom w kierunku absolutyzmu, które charakteryzowały pozostałe państwa Europy. Otwarty konflikt między kanclerzem a królem wybuchł podczas sejmu w 1592 r., kiedy Zamoyski odkrył, że Zygmunt spiskuje, aby scedować koronę polską dla Habsburgów w zamian za ich wsparcie w walce o szwedzki tron. Zamoyski nie zdołał zdetronizować króla, ale udało mu się wywalczyć wolną rękę podczas interwencji w Mołdawii, gdzie w 1595 pomógł hospodarowi Jeremiemu Mohyle w objęciu tronu (bitwa pod Cecorą (1595)). W 1600 r.