W okresie Rzeczypospolitej Obojga Narodów przez Głębokie przechodził ważny szlak handlowy Wilno – Połock. Walory strategiczne i ekonomiczne miasteczka sprawiły, że w 1563 r. zajął je Iwan Groźny, który wypędził dotychczasowych właścicieli i wpisał je do tzw. Piescowoj Knigi, czyli rejestru dóbr podległych bezpośrednio carowi. Władca Moskwy zaproponował nawet królowi Zygmuntowi Augustowi zmianę granic, które miałyby przebiec wzdłuż Bereźwicy, Dzisny i Dźwiny.
Miasto zostało odbite przez Stefana Batorego, co usankcjonował w 1582 r. rozejm w Jamie Zapolskim. Głębokie powróciło do swych właścicieli. Część południowa należała wówczas do kasztelana smoleńskiego Jerzego Mikołajewicza Zenowicza, który pod wpływem Mikołaja Czarnego Radziwiłła przeszedł na kalwinizm. Jego syn, wojewoda brzeski Krzysztof Zenowicz ufundował w Głębokiem zbór, który podobnie jak dwór, nie przetrwał do naszych czasów. Później Zenowiczowie powrócili do katolicyzmu. Pod koniec XVI w. następny właściciel Głębokiego Mikołaj Bogusław Zenowicz wystawił kościół katolicki pod wezwaniem św. Michała, który został doszczętnie zniszczony w czasie najazdu moskiewskiego w 1654 r. Po śmierci Mikołaja w 1621 r. dobra głębockie otrzymała jego córka Anna Zofia, która poślubiła kasztelana wileńskiego Albrychta Władysława Radziwiłła.