Ostatni opolski Piast Jan II Dobry umarł bezpotomnie 27 marca 1532 w Raciborzu, a został pochowany w kościele św. Krzyża w Opolu. Po jego śmierci księstwo opolsko-raciborskie dostało się w całości w ręce margrabiego Jerzego Hohenzollerna (wyraził na to zgodę Ferdynand I Habsburg).
W pierwszej połowie XVI wieku Koźle posiadało 18 okolicznych wsi i 2 folwarki. Miasto Koźle posiadało około 170 domów i 1000 mieszkańców. Przeważała ludność polska.
W 1558 cesarz Ferdynand I Habsburg oddał w zastaw (za pieniądze) ziemie kozielsko-głogóweckie radcy cesarskiemu Ottonowi von Zedlitzowi z Prochowic. W 1559 cesarz wydał edykt nakazujący Żydom opuszczenie terenów dziedzicznych Habsburgów. W rezultacie tej decyzji, w 1563 zakazano tolerowania Żydów w Koźlu i na jego przedmieściach. Równocześnie, w 1563 Johann von Oppersdorff zakupił Koźle – tym samym przestało być ono miastem książęcym, a zaczęło być miastem prywatnym.
Na początku XVII wieku Koźle liczyło 235 domów i 1800 mieszkańców. W mieście znajdował się murowany dwupiętrowy ratusz.