Metylacja DNA – proces przyłączania grup alkilowych (metylowych) (-CH3) do zasad azotowych nukleotydów, w szczególności do cytozyny, rzadziej do adeniny (w pozycji 6). Produktem metylacji cytozyny jest zazwyczaj 5-metylocytozyna, czasem N4-metylocytozyna. W proces ten zaangażowane są enzymy z grupy metylaz DNA.
Istnieje wiele technik służących do badania tego procesu. Przykładowo, można wykorzystać niektóre techniki immunocytochemiczne, ponieważ udało się opracować specyficzne przeciwciała zdolne do wiązania się z 5-metylocytozyną.
Metylacja jest odpowiedzialna za wiele procesów związanych z rozwojem organizmów – w szczególności za wytworzenie i utrzymywanie odpowiedniej specyfikacji tkankowej.
Wzrost metylacji części regulatorowej genu może wywołać zahamowanie jego ekspresji; ogólnie zakłada się, że wysoka metylacja pewnych fragmentów chromatyny związana jest z jej częściową lub całkowitą inaktywacją transkrypcyjną. Innymi słowy duży odsetek zmetylowanych nukleotydów stanowi sygnał dla białek uczestniczących w regulacji struktury chromatyny nakazujący inicjację procesów kondensacji chromatyny, co jest równoznaczne z przemianą euchromatyny w niedostępna dla czynników transkrypcyjnych heterochromatynę.