Dzięki ponownemu przekazaniu protonu przez His-274 tioester ulega hydrolizie. Jako pierwszy od enzymu odłączany jest CoA, a następnie cytrynian. Takie działanie enzymu gwarantuje zajście jedynie hydrolizy cytrynylo-CoA, wykluczając hydrolizę acetylo-CoA, który nie może zostać przyłączony do enzymu, jeśli nie jest on już związany ze szczawiooctanem.
Inhibitorami tego etapu są ATP (gdyż jego obecność świadczy o mniejszym zapotrzebowaniu energetycznym komórki) oraz acyli-CoA o długich łańcuchach alifatycznych (są to reszty kwasów tłuszczowych).
Izomeryzacja thumb|left|ΔG'° = +6,3 kJ/mol thumb|Budowa akonitazy
Cytrynian powstały w poprzedniej reakcji zazwyczaj nie jest przekazywany do środowiska wodnego macierzy mitochondrialnej, ale przechodzi od razu do kolejnego enzymu: akonitazy, czyli hydratazy akonitanowej. Zjawisko to zwane jest chanellingiem. Zwiększa to znacznie szybkość reakcji, bowiem enzym nie musi czekać, aż substrat się na niego „natknie”, ale rozpoczyna katalizę swej reakcji natychmiast po zakończeniu poprzedniej. Poza tym dzięki temu dwie identyczne grupy -CH2COO− są rozróżniane przez enzym: reakcji zawsze będzie ulegała ta pochodząca od szczawiooctanu. Jeśli zaś akonitaza jest wysycona, cytrynian przechodzi do cytoplazmy, gdzie rozpada się na związki, z których powstał.