W Fundacji Johnsona Hartline rozpoczął badania nad działalnością pojedynczych optycznych włókien nerwu w oku kraba Limulus. W połowie 1930 roku przedsięwziął pojedynczą analizę włókna optycznych u kręgowców siatkówki oka, głównie w oku żaby. Na początku lat 1940 Hartline pracował nad problemami nocnych wizji u ludzi. W 1940-1941, był profesorem nadzwyczajnym fizjologii w Cornell, medycznym College’u w Nowym Jorku, ze skąd powrócił do Fundacji Johnson, i pracował tam do 1949.
W 1949 Hartline przyjął posadę na Uniwersytecie Johnie Hopkinsa w Baltimore jako profesor biofizyki i przewodniczącego działu Biofizyki. Tam, kontynuował badania rozpoczęte jeszcze w college’u nad receptorami oka Limulus oraz prowadził badania elektrofizjologiczne oka zwierząt (procesy pobudzania i hamowania w siatkówce oka, regulowanie ostrości obrazu). W roku 1963 za odkrycie chemicznych i fizjologicznych procesów zachodzących w oku i mózgu podczas widzenia, wraz z George’em Waldem i Regnarem Granitem otrzymał Nagrodę Nobla. W 1963 przyjął posadę jako profesor w Uniwersytecie Rockefellera (wówczas Instytut Rockefellera) i pracował tam do roku 1974.