W tej chwili antygen jest już wyodrębniony z mieszaniny, dzięki użyciu swoistego przeciwciała, jednak osoba przeprowadzająca badanie nie jest jeszcze w stanie stwierdzić, czy tak się rzeczywiście stało. W tym celu dodawane jest kolejne przeciwciało, tym razem wyznakowane enzymem. Przeciwciało to również jest specyficzne względem poszukiwanego antygenu, jednak rozpoznaje inny rejon cząsteczki białkowej – dzięki temu przeciwciało użyte do wychwycenia antygenu nie blokuje przeciwciała znakowanego enzymem. Po przepłukaniu uzyskujemy strukturę kanapki – antygen rzeczywiście znajduje się pomiędzy dwiema warstwami przeciwciał. Teraz można dodać już substrat dla enzymu związanego z przeciwciałem. Zwykle stosuje się związki, które w wyniku reakcji enzymatycznej przechodzą w barwny produkt. Taki test ELISA jest więc także metodą kolorymetryczną. Najczęściej stosowane enzymy to fosfataza alkaliczna (substrat: fosforan p-nitrofenolu), peroksydaza chrzanowa (substrat: tetrametylobenzydyna) oraz oksydaza glukozowa (substrat: kwas 5-aminosalicylowy).