W 1906 powrócił do Rio de Janeiro i rozpoczął pracę w Instituto Oswaldo Cruz. W 1909 został wysłany do małej miejscowości Lassance, blisko rzeki São Francisco, w celu zwalczenia epidemii malarii szerzącej się wśród robotników pracujących przy budowie drogi kolejowej do Belém w Amazonii. Pozostał tam przez dwa lata i miał możliwość zaobserwowania infestacji krwiopijnymi pluskwiakami okolicznych wiejskich zabudowań. W jelitach tych owadów z rodzaju Triatoma, nazywanych w tych okolicach barbeiro, Chagas odkrył nieznane nauce pierwotniaki, które, jak doświadczalnie wykazał, mogą zostać przeniesione na małpy. Naukowiec opisał patogenne pierwotniaki pod nazwą Trypanosoma cruzi honorując Oswaldo Cruza; w tym samym roku opisał je jeszcze raz jako Schizotrypanum cruzi, by potem powrócić do pierwszej nazwy, używanej do dziś.
Chagas podejrzewał, że pasożyt może wywoływać chorobę u ludzi, w związku z występowaniem przenoszących go owadów tak blisko ludzkich zabudowań. 23 kwietnia 1909 po raz pierwszy wykazał obecność świdrowców we krwi trzyletniej dziewczynki. Odnotował również inkluzje pasożytów w mózgu i mięśniu sercowym, co pozwoliło połączyć objawy choroby z cyklem życiowym pasożyta.