Tworzą je głównie polskie instrumenty ludowe, w tym instrumenty tradycyjne i narzędzia muzyczne, wykonane przez ludowych twórców, jak również instrumenty profesjonalne, polskie i obce, które znalazły się w obrębie oddziaływania muzyki ludowej i używane przez muzyków ludowych, a także rekonstrukcje instrumentów, które znane są tylko z przekazów źródłowych.
Najstarszymi obiektami są: złóbcoki (1705 r.), basy kaliskie i mazowieckie (XVIII w.), trąbki (XVIII w.), kotły (XVII/XVIII w.), bębenki (XVIII w. i XIX w.). Do najciekawszych należy m.in. największy w Polsce zbiór harmonii różnych typów, duża kolekcja skrzypiec, cymbałów, instrumentów dudowych, piszczałek i instrumentów glinianych. Jedne z najcenniejszych nabytków muzeum to instrumenty należące do legendarnej kolekcji Mariana i Jadwigi Sobieskich, wybitnych polskich etnomuzykologów nabyte przez muzeum w 2014 roku Jest to kilkadziesiąt muzycznych artefaktów, głównie instrumentów muzycznych polskich i bałkańskich, w tym m.in. lira korbowa z końca XIX w. z Rzeszniówki koło Krzemieńca (Ukraina), cymbały rzeszowskie z 1. poł. XX w., skrzypce i basy z lat 20. XX w. Jana Rafalskiego ze wsi Jagodne, instrumentów dudowych z różnych regionów Polski. Inne, cenne nabytki muzeum, to: m.in. dudy podhalańskie Eugeniusza Sieczki w z lat 30.