Również w wyborach parlamentarnych Platforma Obywatelska przegrała niespełna trzema punktami procentowymi z PiS i została partią opozycyjną wobec rządów Kazimierza Marcinkiewicza i Jarosława Kaczyńskiego. Po porażce wyborczej Donald Tusk pozostał liderem swojej partii (podczas partyjnego zjazdu w maju 2006 pokonał ubiegającego się o przywództwo w PO Andrzeja Machowskiego). W wyborach tych uzyskał mandat posła V kadencji, otrzymując 79 237 głosów w okręgu gdańskim. W listopadzie 2006 po raz drugi objął stanowisko przewodniczącego klubu parlamentarnego PO; pełnił tę funkcję do grudnia tego samego roku, kiedy to zastąpił go Bogdan Zdrojewski. W Sejmie V kadencji był członkiem Komisji Łączności z Polakami za Granicą oraz Komisji Odpowiedzialności Konstytucyjnej.
Prezes Rady Ministrów (2007–2014) Pierwszy rząd (2007–2011)