Po wprowadzeniu reformacji, konsolidacja biblioteki oraz przemianowanie uniwersytetu na wyższą szkołę ewangelicką, pozwoliły Ottonowi Henrykowi stworzyć potężne centrum edukacji protestanckiej.
Zbiory Biblioteka posiadała między innymi: Ewangeliarz z Lorsch (niem. Lorscher Evangeliar) ze szkoły dworskiej Karola Wielkiego, Codex Manesse (cpg 848cpg to skrót od Codices Palatini Germanici oznaczający niemieckojęzyczne manuskrypty w zbiorach Bibliotheca Palatina) oraz Falkenbuch (De arte venandi cum avibus, cpl 1071cpf to skrót od Codices Palatini Latini oznaczający manuskrypty łacińskie w zbiorach Bibliotheca Palatina) cesarza Fryderyka II.
Po śmierci jednego z najbogatszych kupców z Augsburga, Ulricha Fuggera (1526-1584), biblioteka otrzymała 86 cennych manuskryptów, m.in. rękopis Ottfrieda von Weißenburga (cpl 52), dzieło Kopernika De revolutionibus oraz ilustrowany manuskrypt Zwierciadła saskiego (cpg 164). Joseph Scaliger uważał, że biblioteka Fuggera posiadała dzieła cenniejsze od papieskiej.
Na początku XVII w. biblioteką zarządzał filolog Jan Gruter (1560-1627), znany jako wydawca Inscriptiones antiquae totius orbis Romanae. Czynił systematyczne zakupy literatury niemieckiej oraz światowej, m.in.