Robi wymówki królowej i zarzuca jej zdradę, nie wierzy w niewinność kobiety. Ta pada zemdlona. Wchodzą Posa i księżniczka Eboli. Posa ręczy za królową, jednocześnie podczas kwartetu stwierdza, że nadszedł czas, by oddać życie za Hiszpanię. Mężczyźni wychodzą, a kobiety zostają same. Księżniczka przyznaje się do zabrania szkatułki, wyznaje że kocha Don Carlosa, który nie odwzajemnia tego uczucia. Wtedy królowa każe jej powstać, Eboli dodaje jednak, że zgrzeszyła z królem tym grzechem, o który oskarżyła królową. Na to królowa każe jej oddać ordery damy dworu. Opuszczona Eboli oskarża swą urodę w dramatycznej arii "O don fatale". Chce odejść do klasztoru, by odpokutować winy wobec swej pani. Przedtem jednak pragnie uratować Carlosa.
Odsłona 2
Markiz Posa przybywa do uwięzionego Don Carlosa. Okazuje się, że markiz wziął na siebie całą winę za wywołanie powstania we Flandrii, o co oskarżony jest Don Carlos. Chce w ten sposób uratować przyjaciela. Nagle pada strzał – śmiertelnie ranny markiz pada na ziemię: zemsta króla była szybka. Żegnając się z Carlosem, Posa wyjaśnia mu, że królowa czeka na niego w klasztorze z dalszymi wskazówkami – umiera szczęśliwy, gdyż wie, że jego przyjaciel uratuje Flandrię. Przybywa król z grandami, chcąc oddać Carlosowi jego szpadę.