Polska parafia ewangelicka Po wprowadzeniu w Prusach Książęcych reformacji w 1525, świątynia służyła ewangelikom litewskim i niemieckim, przed 1574 również polskim, co powodowało konflikty. Od 1603 stała się wyłącznie kościołem polskim (duszpasterstwo litewskie przeniesiono do kościoła św. Elżbiety na Sackheim). Od 1632 do 1742 nabożeństwa polskie były też nadal odprawiane w katedrze na Knipawie, farze staromiejskiej i w kościele św. Barbary na Lipniku. Od 1620 istniał etat duchownego pomocniczego – diakona. Z kościołem było związanych szereg wybitnych polskich duchownych luterańskich. Pierwszym z nich był od 1529 Jan Wnorowski (w katedrze i na Starym Mieście). Od 1544 urząd ten pełnił Jan Seklucjan, który został pierwszym proboszczem polskiej parafii personalnej na Steindamm, obejmującej całe miasto. Do wybitniejszych należeli – przeważnie pochodzący z małych miejscowości mazurskich – księża: Krzysztof Liebruder – założyciel polskiej szkoły w 1642, Wawrzyniec Rast, Jerzy Skrodzki, Fryderyk Mortzfeld – wydawca kancjonału (1684), Jan Jakub Gräber, Marcin Zygmunt Zieleński (Marcin Zygmunt Zieliński), Michał Pilchowski, Jerzy Olech, Marcin Gregor, Herman Pełka, August Grzybowski.