Juan de Ayolas (zm. ok. 1538 w Paragwaju) – hiszpański konkwistador w Ameryce Południowej.
Życiorys Był zastępcą Pedro de Mendozy podczas jego wyprawy z Hiszpanii do Río de la Plata w Ameryce Południowej w latach 1535–1537. Prawdopodobnie w roku 1536 podjął, na rozkaz Mendozy, wyprawę z okolic dzisiejszego Buenos Aires w głąb estuarium la Platy w poszukiwaniu srebra i złota, o czym donosił w swym raporcie żeglarz angielski Sebastian Cabot. Płynąc na północny wschód dotarł do rzeki Paraná zakładając na jej brzegu osadę Corpus Christi. Następnie posuwał się w górę rzeki aż do ujścia Pilcomayo, gdzie zostawił część uczestników wyprawy, by penetrować z kolei bieg rzeki Paragwaj poszukując dogodnego połączenia z Peru. W trakcie podróży otrzymał od Indian Guaraní nieco złota, co rozpaliło wyobraźnię Hiszpanów, choć przypuszczalnie było to złoto pochodzenia inkaskiego z podnóża Andów.
Ayolas, któremu w początkowym etapie podróży towarzyszył Domingo Martínez de Irala, spenetrował wnętrze kontynentu docierając aż do Gran Chaco (lub też do północnej części wyżyny – Chaco Boreal w dzisiejszym Paragwaju i północnej Argentynie i do Kordyliery Wschodniej w Andach Centralnych.