Drugi kościół Na miejscu spalonej świątyni jeszcze w tym samym roku wzniesiono murowany kościół w stylu gotyckim. Jego fundatorem był król Władysław Jagiełło i z jego inicjatywy kościół dostał się w 1418 pod opiekę Akademii Krakowskiej. W 1428, za czasów proboszcza Jana z Wielunia, rozbudowano prezbiterium. W 1473 roku został pochowany w kościele św. Anny profesor Akademii Krakowskiej Jan Kanty. W 1535 roku biskup Piotr Tomicki ogłosił kościół kolegiatą i ustanowił przy nim kapitułę kolegiacką. W 1539 sprawiono dla Jana Kantego nową trumnę, a w 1549 nowy renesansowy nagrobek ufundował rektor Akademii Krakowskiej Jakub Friedel.
W 1680 papież Innocenty XI beatyfikował Jana Kantego. W związku z rosnącym kultem świętego profesorowie Akademii postanowili wyburzyć kościół i na jego miejscu zbudować większy, będący w stanie pomieścić wszystkich pielgrzymów odwiedzających grób Jana Kantego. Kościół wyburzono w roku 1689 na koszt Akademii.