Grupa założycielska kibucu Mesillot zawiązała się w 1932 roku. W jej skład wchodzili żydowscy imigranci z Polski, do których później dołączyli imigranci z Bułgarii. Byli to członkowie młodzieżowego ruchu syjonistycznego ruchu Ha-Szomer Ha-Cair. Przez kilka pierwszych lat uczyli się oni rolnictwa i zdobywali doświadczenie w rejonie osady Nes Cijjona. W lipcu 1937 roku przyjechali do Doliny Bet Sze’an i w dniu 22 grudnia 1938 roku założyli kibuc Mesillot. Była to typowa osada rolnicza, z obronną palisadą i wieżą obserwacyjną. Początkowo nazywał się En Gilboa (hebr. עין גלבוע), a później zmieniono jego nazwę na obecną. Podczas I wojny izraelsko-arabskiej w 1948 roku kibuc został zbombardowany przez iracki samolot. W nalocie zginęła jedna osoba, a kilka zostało rannych. W kolejnych latach do kibucu przyjechali imigranci z Egiptu i Argentyny.
Nazwa Nazwa kibucu oznacza „drogi” i odnosi się do wersetu biblijnego wyrażającego ufność narodu w BogaZobacz: Księga Izajasza 33,8: „Opustoszały drogi, przechodniów zabrakło na ścieżkach. Wróg zerwał układy, odrzucił świadków, nie zważał na nikogo.” Tłumaczenie według Biblii Tysiąclecia..