W drugiej turze wyborów przegrała ze swoim poprzednikiem na urzędzie premiera, otrzymując około 45,5% głosów.
3 marca 2010 Rada Najwyższa Ukrainy wyraziła wotum nieufności dla jej rządu – za wnioskiem głosowało 243 z 450 deputowanych. Premier ogłosiła decyzję o wzięciu urlopu, a pełniącym obowiązki szefa rządu 4 marca 2010 został wicepremier Ołeksandr Turczynow. 11 marca 2010 parlament rozwiązał rząd Julii Tymoszenko i zatwierdził nowy gabinet premiera Mykoły Azarowa.
W kolejnych miesiącach wszczęto przeciwko niej postępowania karne związane z zarzutami defraudacji. W sierpniu 2011 została tymczasowo aresztowana. W październiku tego samego roku uznano ją za winną spowodowania strat przedsiębiorstwa Naftohaz Ukrainy i skazano na karę 7 lat pozbawienia wolności. W grudniu 2011 po uprawomocnieniu się wyroku skazującego osadzono ją w kolonii karnej w Charkowie. Postępowania karne wytaczane Julii Tymoszenko i członkom jej rządu stały się przedmiotem zainteresowania Parlamentu Europejskiego, który w swojej rezolucji skrytykował władze ukraińskie i wezwał do zapewnienia niezależności i bezstronności w procesach przed sądami.